發(fā)布時間：2023-09-05
近日，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院賴良學(xué)課題組在基因蛋白表達水平的雙向定量調(diào)控領(lǐng)域取得了重要突破。相關(guān)成果以“Precise genome editing of the Kozak sequence enables bidirectional and quantitative modulation of protein translation to anticipated levels without affecting transcription”為題在線發(fā)表于Nucleic Acids Research（核酸研究）雜志。該研究以蛋白翻譯調(diào)控元件—Kozak序列為切入點，開發(fā)出一種全新的、普適的策略，用于精細調(diào)控目標基因蛋白表達水平。這種策略在不觸及基因轉(zhuǎn)錄的情況下，既能實現(xiàn)蛋白表達水平的雙向（上調(diào)或下調(diào)）調(diào)控，又能將蛋白表達水平控制在預(yù)測范圍內(nèi)。
基因的表達包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個過程，其表達水平的調(diào)控可以在多個層面上進行，包括基因組、轉(zhuǎn)錄、翻譯等層面。過去的研究已經(jīng)對調(diào)控基因表達進行了大量探索，并取得了許多重要的進展。例如，通過使用基因編輯工具對基因序列進行編輯，引入移碼突變或破壞起始密碼子等，可以實現(xiàn)目標基因的完全敲除；利用組成型啟動子或組織特異性啟動子，可以實現(xiàn)目標基因的過量表達；利用RNA干擾技術(shù)或CRISPR/Cas9激活或抑制系統(tǒng)，可以實現(xiàn)目標基因的激活或抑制。然而，這些策略只能實現(xiàn)目標基因的完全敲除或?qū)⒛繕嘶虻谋磉_量調(diào)控到不可預(yù)測的水平，而不能實現(xiàn)目標基因的可預(yù)測定量調(diào)控。
在真核細胞的mRNA中，非翻譯區(qū)（Untranslated Region，UTR）存在調(diào)控基因翻譯的元件，如Kozak序列、上游開放閱讀框（Upstream Open Reading Frame, uORF)等。有課題組針對uORF進行設(shè)計，建立了精細上調(diào)或下調(diào)內(nèi)源基因翻譯的方法，并成功應(yīng)用到植物分子設(shè)計育種領(lǐng)域。但該策略無法定量地將蛋白表達控制在特定水平。Kozak序列是翻譯起始附近的序列，對于核糖體正確識別翻譯起始密碼子具有直接關(guān)系，其序列的不同，會導(dǎo)致蛋白合成量的差異，這提示了通過改造基因Kozak序列可能獲得不同翻譯效率的調(diào)控效果。
因此，該研究基于對編碼基因Kozak序列的精確操作，提出了一種名為KZ3-edit的新型基因表達調(diào)控策略：利用精準基因編輯技術(shù)在DNA水平上精確修飾起始密碼子上游的3個核苷酸（這是Kozak序列的一部分，堿基偏好最顯著，被命名為KZ3），這足以高效調(diào)控基因的翻譯效率。在不改變基因的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)序列的情況下，對mRNA的翻譯水平進行定量和雙向調(diào)控，從而將蛋白表達精細地控制在預(yù)期的水平。通過體外雙熒光報告系統(tǒng)、綠色熒光細胞系及內(nèi)源基因三個層面，研究人員驗證了KZ3-edit策略的有效性和靈活性，并證實通過精準基因編輯工具對基因主效開放閱讀框（Primary Open Reading Frame, pORF）或uORF起始密碼子上游KZ3序列的單個堿基改變或堿基組合轉(zhuǎn)變，可以實現(xiàn)特定基因翻譯水平的高效調(diào)控。
此外，研究人員還將該策略應(yīng)用于家兔生物性狀的調(diào)控，分別以調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的PCSK9基因和調(diào)控毛發(fā)生長周期的HR基因為靶基因。一方面，通過改變PCSK9基因的pORF的KZ3序列來直接降低PCSK9蛋白表達量，成功構(gòu)建了低膽固醇家兔模型；另一方面，通過修飾HR基因的uORF—U2HR，改變其KZ3序列而間接上調(diào)HR基因的蛋白表達量，成功構(gòu)建了遺傳性少毛癥家兔模型。這兩種家兔模型的成功構(gòu)建為KZ3-edit策略在基因的精細調(diào)控中的應(yīng)用，以獲得目標生物性狀提供了范例。
該研究提出了一種普適、高效、靈活的基因翻譯調(diào)控新策略，可以對目標基因起始密碼子前三個堿基進行直接基因編輯，從而實現(xiàn)雙向定量調(diào)控目標基因翻譯水平的效果。這種策略理論上可以應(yīng)用于真核生物所有的編碼基因，且該策略調(diào)控翻譯的有效性、設(shè)計簡便性以及應(yīng)用多樣性將為基因功能研究、人類遺傳疾病模型構(gòu)建與治療、農(nóng)業(yè)精準分子設(shè)計育種等提供重要的技術(shù)手段。
本研究中，廣州健康院謝精科副研究員、莊鎮(zhèn)鵬博士和茍士學(xué)博士為共同第一作者，王可品研究員和賴良學(xué)研究員為共同通訊作者。該研究成果得到了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學(xué)基金、海南省科技計劃、廣東省科技計劃、中國科學(xué)院青年創(chuàng)新促進會等項目的資助。
KZ3-edit策略原理圖
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